[Real Time PCR]#20 circulating miRNA 정량을 위한 분석 전 변수의 영향

이진현
2021-11-11
조회수 946

목차

1.개요 및 목적

2. 실험 재료 및 기기

3. 실험 방법 및 절차

4. 실험 결과

5. 주의 사항

6. 관련 자료

1. 개요 및 목적


1. 개요 및 목적

  생물학적 가능성이 충분한 miRNA의 임상적 유용성에 영향을 미치는 분석 전 변수에 관한 연구가 많이 없습니다. 하지만 임상적 실험 환경에서  circulating miRNA 정량의 신뢰할 수 있는 결과를 위해 좀 더 적합한 혈액 검체를 찾는 것이 중요하다고 판단되었습니다. 이에 혈액 채취 용기 내 첨가물, 원심분리 속도, 혈액 응고 과정, 세포 오염과 같은 다양한 환경의 영향을 실험하였습니다.

2.실험 재료 및 기기


2. 실험 재료 및 기기

[채혈 용기]

-ethylenediaminetetra-acetic acid(EDTA) tube

-serum separator tube(SST)

-sodium citrate tube

-plain tube


[사용 기기]

-원심분리기

-혈구세포분석기기 (sysmex XE-2100)

-conventional PCR 기기 (iCycler Thermal Cycler)

-quantitative PCR 기기 (ABI7500 real time PCR system)


[시약]

-PBMC 분리 시약 (Ficoll Paque PLUS)

-miRNA isolation kit (mirVana PARIS kit)

-IC (Caenorhabditis elegans miRNA 39)

-reverse transcription kit (Taqman miRNA RT kit, miRNA-specific stem-loop primers)

-real time PCR kit (Taqman Universal PCR master mix-ABI, miRNA primer&hydrolysis probes-ABI)


[분석 프로그램]

PASW statistics 18.0 software 

3. 실험 방법 및 절차


3. 실험 방법 및 절차

[검체 채취]

1. 건강한 성인의 혈액을 EDTA, sodium citrate, SST, plain 용기에 채취

2. 모든 검체는 냉장(4℃)에서 (1) 795g/ 20분, (2) 15,000g/ 10분, 두 조건으로 원심분리를 한 후 상층액 수거

3. 원심분리한 혈장과 혈청은 2/3 상층, 1/3 하층으로 구분하여 채취하였고 각각 혈구세포(WBC, RBC, PLT)의 수를 측정

4. 고속 원심분리를 추가로 시행한 혈청에 임의로 분리한 단핵구(serial dilution: 10,000, 1,000, 100, 50, 25, 12 WBCs in 400uL serum)를 첨가

5. sodium citrate, plain 용기의 혈액을 채혈 직후에 분주하여 5, 10, 20, 25, 30 분 경과한 후 원심분리 


[miRNA 분리]

- 400uL plsma, serum 에 50pmol/L cel-miR-39 첨가하여 진행

- 50uL elution solution 사용

 

[RT]

 nuclease-free H2O 4.5 uL
 5X Taqman miRNA RT primer 3 uL 
 100 mmol/L deoxynucleoside triphosphates 1.5 uL
 50 U/uL MultiScribe reserve transcriptase 1 uL
 eluted RNA 5 uL
 Total  15 uL

-16℃, 30분 > 42℃, 30분 > 85℃, 5분


[quantitative PCR]

 nuclease-free H2O 7 uL
 2X Taqman Universal PCR master mix 10 uL
 20X Taqman miRNA Assay primer 1 uL
 RT product   2 uL
 Total 20 uL

- 95℃, 10분 > (40cycles) 95℃, 15초/ 60℃, 60초


[분석] 

- target 의 △Ct 값을 구해 비교, 분석 (  △Ct 값 = target의 Ct값에서 cel-miR-39 Ct값을 뺀 것)

4. 실험 결과


4. 실험 결과

- 7일 간의 검체 보관 시간이 경과할수록 혈청보다 혈장에서, 냉장온도보다 상온에서 변화량이 커짐

- 임의로 첨가한 단핵구 수가 증가할수록 miRNA 양도 증가

- 혈장은 상/하층 간의 변화 폭이 큰 반면 혈청에서는 거의 변화 없음

- 혈장에서는 원심분리 속도가 높을 수록 miRNA 양이 현저히 적은 반면 혈청에서는 큰 차이 없음

- 혈액 응고 과정 동안 miRNA 양이 증가하는 경향은 있으나 유의미한 차이는 아님



5. 주의사항


5. 주의 사항
- 혈청과 혈장의 상층액을 수거할 때 검체 수면에서부터 pipette tip을 따라가듯이 움직이도록 한다.

6. 관련 자료


6. 관련 자료

- Kirschner MB, Kao SC, Edelman JJ, et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. Plos one 2011; 6: e24145

- Validation of circulating miRNA biomarkers for predicting lymph node metastasis in gastric cancer, J Mol Diagn. 2013 




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