[Real Time PCR]#19 Plasma로 부터 분리한 RNA에서 miRNA 검출

김현미
2021-11-11
조회수 1041

목차

1.개요 및 목적

2. 실험 재료 및 기기

3. 실험 방법 및 절차

4. 실험 결과

5. 주의 사항

1. 개요 및 목적


1. 개요 및 목적

Plasma로 부터 분리한 RNA에서 miRNA 검출

-micoRNA (miRNA)는 자연적으로 생기는 20 nucleotide 정도의 noncoding RNA 이다. miRNA는 전사 후 유전자 조절 과정을 중재하며, 분화와 발달, 세포 신호전달과 감염에 대한 반응을 비롯한 수많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을 하고 있습니다. miRNA의 발현을 통해 체내의 많은 질병 진단에 효과적인 물질로서의 의미를 더하고 있다. Plasma로 부터 추출한 RNA로 부터 miRNA를 검출하는 법에 대한 실험을 소개한다. 

2. 실험 재료 및 기기


2. 실험 재료 및 기기

1) 사용기기

   ① Conventional PCR machine

   ② Real time PCR machine(CFX96-BioRad 사용)

   ③ Centrifuge 

   ④ Nano-drop(Thermo) 

   ⑤ 파이펫

2) 사용 시료/시약

   ① Plasma 시료 

   ② RNA 추출 키트(Serum miRNA purification kit-Genolution 사용) 

   ③ Poly A tailing kit

   ④ RT kit

   ④ Real time PCR kit

3) 기타 실험 재료

   ① E-tube

   ② 8 strip tube/cap

3. 실험 방법 및 절차


3. 실험 방법 및 절차

1) Plasma로 부터 RNA 추출 

   ① Lysis buffer(파란색) 가 들어있는 tube에 plasma를  200ul 넣은 후 20sec vortexing

   ② Chloroform 200ul를 추가한 후, 10sec vortexing

   ③ 원심분리-13,000 rpm, 10min, 4℃, 층분리 확인- (아래부터- 파란색,  흰색, 투명)

   ④  투명한 상층액을 파이펫으로 분리하여 새로운 1.5ml tube로 옮겨준다 (200ulul씩 3번), 이때 하얀 층이 딸려오지 않도록 한다. 

   ⑤ 상층액에 sopropanol을  800ul 넣어준 후 inverting 후, 원심분리-13,000 rpm, 5min, 4℃

   ⑥ Pellet 만 남기고 상층액을 제거한다. 파이펫을 사용하여 pellet이 떨어져 나가지 않도록 주의 한다. 

   ⑦ 70% Ethanol 1ml 을 넣어 wash 한 후, 2min 동안 spin down 하고, 파이펫으로 Pellet 만 남기고 상층액을 제거한다. 파이펫을 사용하여 

       pellet이 떨어져 나가지 않도록 주의 한다. 

   ⑧  Spin down한 남아있는 ethanol을 완전히 제거한다. 

   ⑨ RNase free water를 30ul 넣은 후 pellet을 녹인다.

   ⑩ 정량 후, -20℃ 보관

2)Poly A tailing

   ① 1.5㎖ tube에 [Table 1]의 조성에 따라 mixture를 만든다(plasma로부터 추출한 RNA 4종을 사용).

   ② Mixture 뚜껑을 완전히 닫고, 5초간 tapping 하거나 vortexing하여 균일하게 혼합한 후 spin down한다.

   ③ 0.2㎖ PCR tube에  각 mixture를 18ul씩 넣은 후, 추출한 RNA 샘플을 2ul 씩 넣는다. Cap을 닫고 tapping하여 혼합 후 spin down한다 

   ④ Conventional PCR 장비에  PCR tube를 넣는다. 

   ⑤ 아래 조건으로 PCR을 수행한다.

   ⑥ Product를 RT를 위해 보관한다(4℃)

3) Reverse Transcription

   ① 1.5㎖ tube에 [Table 1]의 조성에 따라 mixture를 만든다.

    ② Mixture 뚜껑을 완전히 닫고, 5초간 tapping 하거나 vortexing하여 균일하게 혼합한 후 spin down한다.

    ③ 0.2㎖ PCR tube에  각 mixture를 18ul씩 넣은 후, Poly A product 2ul 씩 넣는다. Cap을 닫고 tapping하여 혼합 후 spin down한다 

    ④ Conventional PCR 장비에  PCR tube를 넣는다. 

    ⑤ 아래 조건으로 PCR을 수행한다.

    ⑥ Product를 Real time PCR을 위해 보관한다(4℃)

3) Real time PCR

    ① 1.5㎖ tube에 [Table 1]의 조성에 따라 mixture를 만든다

        (3종의 miRNA target과 1종의 internal control에 대한 oligo mix를 각각 만든다) .

    ② Mixture 뚜껑을 완전히 닫고, 5초간 tapping 하거나 vortexing하여 균일하게 혼합한 후 spin down한다.

    ③ 0.2㎖ PCR tube에  각 mixture를 18ul씩 넣은 후,RT product(cDNA)를 2ul 씩 넣는다. Cap을 닫고 tapping하여 혼합후 spin down한다 

    ④ Real time PCR 장비에  PCR tube를 넣는다. 

    ⑤ 아래 조건으로 PCR을 수행한다.

   ⑥ 결과를 분석한다.

4. 실험 결과


4. 실험 결과

    ① 각각의 Ct값을 확인한다.

    ② 4종의 plasma(그래프 색깔별)로부터 추출된 RNA를 가지고 3종의 miRNA target과 1종의 internal control을 검출한 결과를 나타었다.
Internal control의 Ct 값을 기준으로 각 Ct를 normalization 하여 plasma별 target miRNA의 발현량의 차이를 비교할 수 있다.

5. 주의사항


5. 주의 사항

   ① RNA추출 시 degradation이 되지 않도록 장갑을 필히 착용하고,추출 후 시료의 냉동과 해동을 줄이기 위해 시료를 사용할 만큼씩 분주해 놓고 

      사용시 꺼내 쓰도록 한다.

    ② Poly A, RT 각각 과정에서 product를 사용시, 뚜껑에 붙어 있는 시료가 오염되지 않도록 주의한다. 

    ③ Poly A된 product는 불안정 하므로 당일 사용하고 사용하지 못한것은 폐기 하는것이 좋다. 





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