[PCR]#17 Mouse pup genotyping 실험

고현정
2021-11-10
조회수 1005

목차

1.개요 및 목적

2. 실험 재료 및 기기

3. 실험 방법 및 절차

4. 실험 결과

5. 주의 사항

1. 개요 및 목적


1. 개요 및 목적

저희 실험실에서는 Knock out mouse를 교배해서 만들어내기 위해 Hetero x Hetero 교배를 하고 있습니다.

3주령 가량 된 pup들의 꼬리를 잘라서 유전자형 별로(Hetero, Wild type, Knock out)분류하여 실험하기 위해 유전자 판독을 진행하고 있습니다.

2. 실험 재료 및 기기


2. 실험 재료 및 기기

1.전기영동기(mupid ex)

2.gel mold

3.0.5x TAE  buffer

4.3차 증류수

5.redsafe(intron사) = EtBr 대체제로써 인체에 무해합니다.


6.PCR master mix(Takara)

7.primer(forward, reverse)

8.HPLC DW

9.PCR tube


10.NTES buffer

11.proteinase K

12.분자 실험용 isopropanol

13.분자 실험용 에탄올

3. 실험 방법 및 절차


3. 실험 방법 및 절차

*DNA PREP

1.mouse 꼬리 끝을 0.5cm 정도 잘라서 ep tube에 넣는다.

2.tube당 NTES buffer 750ul를 넣고 proteinase K를 7.5ul씩 넣습니다.(Proteinase K 냉동보관, 점성이 진하기때문에 tip 푹담그지 말고 표면에서 따서 쓸것. 그렇지 않으면 loss많이 생김)

3.vortex해주고 56도 waterbath에서 녹인다(3hr~overnight)

4.꼬리가 다 녹았는지 육안으로 확인하고, vortex를 해준다(뭉쳐진게 없고 털이 흩뿌려지면 다 녹은것)

5.13200rpm, 10min, room temperature(NTES buffer에 SDS가 있기때문에 온도가 낮으면 결정이 생길 확률이 있음)로 원심분리해준다.

6.새 튜브에 500ul isopropanol을 넣고 sup 500ul을 살살 섞어준다(pipetting 금지, vortex금지)

7.12000rpm,10min RT

8.sup 버리고 70% 에탄올(분자실험용) 500ul씩 넣어준다.

9.12000rpm,10min RT 

10.sup버리거나 suction하고 완전히 마를때까지 air dry(suction안할때는 티슈 위에다 튜브 뒤집어서 엎어놓고 말림)

11.HPLC DW를 Pellet의 크기로 가늠하여 100ul-400ul정도 넣어주고 최소 3hr ,4도씨에서 녹여준다.


*PCR

12.pellet안건들이면서 살살 pipetting 후 12000rpm,10min, 4C 원심분리

13.PCR mix 만들고 pcr tube당 9ul씩 aliqout

14.상층액 1ul씩 따서 mix와 섞어준 후 spin down하여 PCR시작.


*Electrophoresis

15.pure agarose powder 1g + 0.5x TAX buffer 100ml 섞어주고 투명해질때까지 전자레인지에 돌린다(보통 2min)

16.중간에 한번 꺼내서 한번 섞어주고 20초 정도 더돌린후 식힌다.

17.gel이 미지근해지면 Redsafe 5ul를 넣고 섞어준 후 gel mold에 부어 30-40min정도 굳힌다.

18.잘 굳고 탱탱해지면 전기영동 시작.

19.UV Detector나 gel doc에서 detection한다.

4. 실험결과


4. 실험 결과

5. 주의사항


5. 주의 사항
1.DNA Prep과정에서 절대로 vortex하지 않는다. 

2.gel을 만들고 너무 오래 바깥에 두면 마르기때문에 시간에 유의해서 전기영동한다.

3.Redsafe같은경우는 EtBr보다 안정하지 않기 때문에, 하루이상 지난 gel을 다시 녹여서 사용할때에는 기존 사용량의 70%정도 추가해준다.

4.DNA는 물에 녹아있는 상태이므로 냉장에 오래두면 Degradation되기 때문에 냉동보관한다.




고현정 010-4330-1343



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