[PCR]주방세제로 추출한 DNA를 활용하는 유전자 검사 실험 방법 개발

관리자
2024-01-24
조회수 864

목차

1.개요 및 목적

2. 실험 재료 및 기기

3. 실험 방법 및 절차

4. 실험 결과

5. 주의 사항

6. 관련 자료


1. 개요 및 목적

1. 개발목적

 

가. 현재 교과서에 실린 주방세제 활용 DNA추출 실험의 문제점

교과서에 나오는 주방세제를 이용한 DNA 추출 실험과정에서 나타나는 흰 실타래처럼 보이는 물질을 지금까지는 그것이 DNA라고 일방적으로 믿게 하거나 메틸렌블루로 염색하여 증명하였는데, 사실은 흰 실타래처럼 보이는 물질의 상당 부분이 단백질로 메틸렌블루가 단백질도 함께 염색하는 특성이 있어 메틸렌블루에 염색되었다고 하여 이것이 DNA라고 하는 것에는 문제가 있으며 또한 실타래처럼 보이는 물질이 없으면 DNA 추출에 실패한 것처럼 생각하게 되는 오개념을 형성할 수 있는 문제가 있다.

 

나. 문제점에 대한 개선 방안

흰 실타래처럼 보이는 물질이 DNA라면 이를 전기영동했을 때 사람의 total DNA의 경우 약 10kb 근처에서 밴드가 형성되면서 쭉 끌리는 형태로 나타날 것이기 때문에 전기영동으로 이를 입증할 수 있을 것이고 또한 이 DNA를 이용하여 PTC 미각 유전자의 일부를 PCR로 증폭하여 PCR 결과물을 전기영동으로 확인한다면 더욱 흥미로운 실증적 실험이 될 것이다.


2. 실험 재료 및 기기

- 아래 테이블 참조


3. 실험 방법 및 절차

2. 주방세제를 이용한 구강세포 DNA 추출 실험과정

가. 실험기구 및 시약

실험기구

시약과 재료

micropipette, microcentrifuge, heating block

팝브러시, 100% ethanol, 25% 세제액, 8% 소금물, 소화제용액(다제스 캡슐 내용물을 10mL멸균증류수에 녹임), 1.5mL tube


나. 실험과정

1) 마이크로튜브에 8% 소금물과 25% 세제액을 각 250uL씩, 소화제용액 30uL 넣는다.

2) 팝브러시를 입에 넣고 구강세포가 브러시에 최대한 많이 붙을 수 있도록 볼 안쪽을 1분간 마찰한다.

※ 브러시에 침이 많이 묻어 나오도록 하는 것이 다량의 구강세포 획득에 유리하다

3) 마이크로튜브에 팝브러시를 넣고 손잡이를 빠르게 회전하여 브러시에 묻어있는 구강세포가 잘 떨어져 나오도록 하고 브러시를 튜브에서 뺄 때도 브러시에 묻은 액체가 최대한 튜브로 분리될 수 있도록 회전원심력을 이용한다.

4) 마이크로튜브를 55℃ 히팅블록에 넣어 10분간 인큐베이션한다.

5) 인큐베이션 후 마이크로튜브를 부드럽게 5회 invert mix하고 1분간 식힌 후 냉동 보관된 에탄올 800uL를 마이크로튜브에 비스듬히 흘려 넣고 매우 천천히 튜브를 수평으로 했다가 바로 세우는 동작을 2회 하면서 시료와 에탄올층 사이에 흰 실타래 또는 반투명한 고형물이 생기는 것을 확인한다.

6) 마이크로튜브를 13,500RPM으로 2분간 원심분리한다.

7) 마이크로튜브 내의 상등액을 제거한 뒤 빈 튜브를 다시 한번 원심분리하여 튜브벽에 묻은 액체를 바닥으로 모으고 이를 마이크로페펫을 이용하여 제거한다.

8) 마이크로튜브에 멸균증류수 100uL 넣고 바닥의 흰색 물질을 약 1분간 in & out pippeting으로 잘 녹인다.

※ 바닥에 흰 고형물이 보이지 않으면 멸균증류수 60uL만 넣고 바닥의 보이지 않는 물질을 잘 녹이고 이 경우에는 9)과정은 생략한다.

9) 다시 한번 마이크로튜브를 13,500RPM으로 원심분리하고 상등액만을 새 마이크로튜브로 옮긴다.


※ 기존의 실험 방법과의 차이점

흰 실타래 형상의 DNA 추정 물질을 팝브러시를 이용하여 효율적으로 분리할 수 있으며 이렇게 함으로써 PCR에 방해되는 성분도 최대한 분리하는 것이 가능

히스톤 단백질을 분해하는 방법으로 쉽게 구할 수 있는 소화제를 이용


 

 

[참고] - 시판 중인 다른 DNA 추출 키트와의 비교 연구 실험

가. Genomic DNA 추출키트(인트론.G-spinTM Total DNA Extraction Kit Cat. No. 17045)를 이용한 구강세포 DNA 추출

1) 실험기구 및 시약

실험기구

시약과 재료

micropipette, microcentrifuge, heating block, vortex mixer

Buffer(CL, WA, WB, CE), Proteinase K, 100% ethanol, spin column


2) 실험과정

① 10ml의 물로 입안을 30초간 세차게 가글하여 종이컵에 받는다.

② 1.5mL tube에 가글액을 1.5mL 넣고 13500rpm으로 1분간 원심분리한 후 상등액을 버리고 다시 가글액 1.5mL를 넣고 원심분리하는 것을 3회 반복하여 바닥에 pellet을 증가시킨다.

③ Buffer CL 400㎕, Proteinase K 20㎕를 sample tube에 차례로 넣고 강하게 볼텍싱한 후 바로 56℃에서 30분간 인큐베이션 한다.

(주의:Proteinase K는 항상 –20℃ 이하에서 보관).

④ 100% ethanol 400㎕를 시료에 넣고 invert mix 5~6회 한 후, 원심분리기에 넣고 시료를 spin down한다.

⑤ 800㎕의 내용물을 취하여 spin column의 내벽에 묻지 않게 잘 넣고 뚜껑을 닫은 후 13500rpm으로 1분간 원심분리한다. 그리고 2mL collection tube 안의 여과액은 버린다.

⑥ Buffer WA 700㎕를 spin column의 벽에 묻지 않게 넣고 13000rpm으로 1분간 원심분리하고 2.0mL collection tube는 재사용한다.

⑦ Buffer WB를 spin column 벽에 묻지 않게 700㎕ 넣고 13000rpm으로 1분간 원심분리하고 2.0mL collection tube의 여과액은 버린다. 그리고 1분간 추가로 원심분리하고 여과액과 collection tube를 함께 버린다.

⑧ spin column을 새로운 1.5mL tube에 장착하고 Buffer CE를 60㎕를 막에 직접 떨어뜨리고 1분간 실온에서 배양한 후 13000rpm으로 1분간 원심분리하여 최종적으로 DNA 추출을 완성한다.

 

나. DNA ZOL 이용한 구강세포 DNA 추출


실험기구

시약과 재료

micropipette, microcentrifuge

DNA ZOL, 100% ethanol, 70% ethanol, 증류수


1) 10mL의 물로 입안을 30초간 세차게 가글하여 종이컵에 받는다.

2) 1.5mL tube에 가글액을 1.5mL 넣고 13500rpm으로 1분간 원심분리한 후 상등액을 버리고 다시 가글액 1.5mL를 넣고 원심분리하는 것을 3회 반복하여 바닥에 pellet을 증가시킨다.

3) DNA ZOL을 200㎕ 넣은 후, 파이펫을 이용해서 용액과 세포가 잘 섞이게 한다.

4) 원심분리기를 이용하여 10000rpm으로 10분간 원심 분리한 후 상층액을 조심스럽게 새로운 E-tube에 옮겨 담는다.

5) 옮긴 tube에 100% ethanol을 조심스럽게 넣어주면 층이 생기는 부분에서 하얀 실 같은 DNA를 볼 수 있다.

6) 원심분리기를 이용하여 13000rpm으로 1분간 원심 분리한다.

7) 상등액을 버린 후, 70% ethanol을 넣어준 뒤 다시 13000rpm으로 1분간 원심 분리한다.

8) 상등액을 버린 후, 증류수 30uL을 넣어 녹여 최종적으로 DNA추출을 완성한다.

 

3. 전기영동 결과

가. 1.5% 아가로즈 겔(gel-red포함) 제작

실험기구

시약과 재료

전자레인지, 250mL 플라스크, 랩, 목장갑, 전자저울, 약포지, 겔 트레이

아가로즈 분말, gel-red,

TAE buffer액


1) 1g의 아가로즈를 약포지에 정량하여 250mL의 플라스크에 넣는다.

2) 100mL의 TAE buffer액을 넣는다.

3) 플라스크의 입구를 랩으로 막고 구멍을 몇 개 뚫는다.

4) 분말을 잘 흔들어 섞고 완전히 녹을 때까지 전자레인지에서 녹인다.

(주의: 액이 최초로 끓기 시작하면 바로 꺼내어 흔들어주고 이후 끓을 때마다 이와 같은 과정을 3~4회 반복하여 아른거리는 것 없이 맑게 보일 때까지 반복하여 끓어 넘치지 않게 한다.)

5) 약 1분 식힌 후에 gel-red 5㎕를 넣고 부드럽게 잘 섞는다.

6) 졸 상의 아가로즈용액을 겔 트레이에 붇고 콤을 꽂아 굳힌다.

 

나. 전기영동

실험기구

시약과 재료

전기영동장치, agarose gel,

UV-transilluminator

DNA, 6×Loading dye, TAE buffer액


1) 파라필름 조각을 실험대 위에 잘 붙이고 그 위에 DNA Loading dye 1.5㎕ 떨어뜨린 후, Loading dye에 DNA 시료 7.5㎕를 넣고 잘 섞는다.

2) 전기영동 탱크에 아가로즈 겔을 넣고 아가로즈 겔을 2mm 정도 덮도록 TAE buffer를 붓는다.

3) 아가로즈 겔의 well에 좌측부터 3개씩 각자의 DNA를 DNA Zol, 세제, Genomic DNA 추출키트 순으로 주입한다.

4) 장치의 뚜껑을 덮고 전원을 연결하여 100V에서 20분간 전기영동을 실시한다.

5) Loading dye가 겔의 중간 정도로 내려오면 전원을 끄고 UV-transilluminator 위에 겔을 올려놓고 결과를 관찰한다.

□ 실험결과



                  1       2       3      4       5       6      7       8      9      10     11    12    








1, 4, 7, 10 - 졸
2, 5, 8, 11- 세제
3, 6, 9, 12 - 키트

전기영동 결과, 모두 밴드가 잘 나와 DNA 추출에 성공했음을 확인할 수 있다.



4. 세제로 추출된 DNA를 이용한 PCR 실험

: PTC 미맹 유전자(Tas2R38 Bitter Taster Receptor) 검사를 위한 PCR

단일 뉴클레오타이드 다형성(Single-Nucleotide Polymorphism)에 의한 PTC 미각 유전자의 다양성에 대한 유전자 검사를 한다.


1) PCR primer

PCR primer

SEQUENCE (5' → 3')

길이

TAS2R38-Fdw

ccttcgtttt cttggtgaat ttttgggatg tagtgaagag gcag

44 mer

TAS2R38-Rev

aggttggctt ggtttgcaat catc

24 mer

 

2) PCR 시료조성

Components

Volume

PCR premix(dNTP,buffer,Taq polymerrase)

건조시료

F-primer(10ng/uL)

1 uL

R-primer(10ng/uL)

1 uL

주형 DNA

2~4 uL

멸균증류수

14~16 uL

Total

20 uL


3) thermocycle 조건

Stage

Cycle

Step

온도

시간

1

1

1

94℃

5min

2

35

1

94℃

30s

2

64℃

45s

3

72℃

45s

3

1

1

72℃

5min

2

4℃

∞ (hold)


 

4. 실험 결과와 결과의 해석

-221bp위치에 밴드가 나타나 PCR 성공


5. 주의 사항

6. 관련 자료, 참고 논문

[부록] 창의력 증진을 위한 나만의 전기영동기 / hand PCR 장치 제작법

1. 전기영동장치 만들기 https://youtu.be/eyvu7irvIoU 

준비물

270mL락엔락통, 1mm스텐레스철사, 니퍼, 스카치테이프, 집게전선, 9v전지스냅, 검정종이, 겔케스터, 겔트레이, 콤

1. 그림과 같이 1mm스텐철사 120mm길이 2개 준비하고 55mm, 35mm지점 두 군데를 수축튜브를 끼우고 구부리며, 릭엔락통의상단(그림 참조)에 송곳으로 구멍을 뚫고 그림과 같이 처럼 끼우 스텐레스 철사를 락엔락통에 장착한다.

2. 집게전선 2개와 9V전지스냅의 가운데를 잘라서 음극, 양극을 각각 연결할 수 있도록 준비

  
3. 전지4개를 그림과 같이 직렬연결하고 전지스냅을 연결한다
4. 전체적인 연결 모습.
5. 48V어댑터를 전원으로 사용 할 수 있음.

6. 어댑터잭용 집게전선 어댑터 준비
7. 전원 연결
8. 48V어댑터 전기영동기 모습



2. 항온 수조 3개를 이용한 핸드 PCR 장치 만들기

 가. 항온수조 만들기

준비물
디지털온도조절기(DC 12V or AC 220V), 코드전선(1~2m), 온수히터봉, 전기납땜용구, 와이어커터, 수축튜브, 멀티탭

 
1. 온수히터봉의 전선을 히터봉에서 30cm지점을 절단하고, 일반 코드 전선은 7cm길이 2개를 그림과 같이 끝부분을 벗겨 구리선이 10mm정도 노출되도록 준비한다.
2. 온수히터봉과 온도조절기의   결선도
3. 7cm전선 두 개는 그림과 같이 온도조절기에 연결하고 콘센트연장선과 온도조절기 전원선과는 직렬로 연결, 히터봉전선과 온도조절기 스위치 연결선은 병렬로 연결하여 전체가 그림2의 결선도와 같이 연결될 수 있도록 한다,
4. 결선 부위에서 합선되지 않도록 전선 주위를 절연테이프로 잘 감싼다.
5. 온도쎈서는 그림과 같이 히터봉에 근접될 수 있도록 스텐레스철사로 연결한다.
6. 완성된 모습
7. 비커에 넣어 작동하는 모습


나. PCR 장치 만들기

준비물
항온수조 3개, 손잡이 달린 floating rack, 초시계, 20uL피펫팁(UF pcr용 20uL피펫팁 microtube 제작용), 가스라이터
제작 방법

1. 항온수조 3개 제작


2. 손잡이 달린 floating rack 제작

 : 5mm두께의 압축스펀지보드(floating rack)를 50*30mm정도의 크기로 자르고 송곳으로 필요한 PCR tube의 수만큼 적당한 간격으로 구멍을 뚫고 압축스펀지보드 중앙에 200uL피펫팁을 뾰족한 부분으로 압축스펀지보드에 구멍을 뚫어 끼우고 피펫팁 끝을 라이터불로 조금 녹여 눌러 피펫팁이 빠지지 않게 하여 floating rack 손잡이를 만든다.


3. UF pcr용 20uL피펫팁 microtube 제작

 : 20uL피펫팁의 끝부분을 라이터불로 살짝 녹여 손으로 눌러 붙이고 다시한번 끝부분에 불을 가까이 하여 끝부분이 둥글게 막히도록 마무리한다, 세 개의 각 온수히터 전선의 중간에서 두 가닥의 전선 중 한 가닥만 절단하고 절단된 전선의 끝부분 5mm를 벗기고 3개의 디지털온도조절기의 자동스위치 단자에 각각 연결한다.


사용법

1. 세 개의 디지털온도조절기에 각각의 온도(92℃, 72℃, annealing 온도)를 설정한다.


2. 세 개의 수조에 물을 먼저 담고 이어서 세 개의 온수히터봉에 각각 온도쎈서를 스텐레스 철사를 이용하여 결합하고 발열체 전체가 잠기도록 물에 넣는다.


3. 디지털온도조절기와 히터의 전원을 차례로 연결하고 멀티탭(스위치부착)의 전원을 켠다.

※ 주의 : 히터봉의 작동은 항상 물 속에 있을 때 작동시키며 사용 후 끌 때도 물속에 있는 상태에서 끄고 최소한 1분 후에 물에서 꺼낼 수 있으며 이 때 히터봉이 아직 뜨거울 수 있으므로 봉은 만지지 않도록 한다.

4. 디지털온도조절기 초기 설정 세팅 : set버튼을 길게 눌러 세팅 준비 상태로 만들고 세팅 모드가 나타나면 위와 아래 화살표 버튼을 조작하여 세팅 수치 입력하고 다시 set버튼을 짧게 누르면 다음 모드 설정으로 이동.

- P0 : 가열모드(H), P1 : 재시작온도차(0.1), P2 : 최고온도(120), P3 : 최저온도(0), P4 : 작동지연시간(0) 


5. 원하는 온도 설정 : set버튼을 짧게 누르면 SV창의 숫자가 깜박이고 원하는 온도를 위와 아래 화살표 버튼을 조작하여 온도 입력하고 다시 set버튼을 짧게 누르면 설정 완료.


6. 수조에 물을 먼저 담고 이어서 온수히터봉의 발열체 전체가 잠기도록 물에 넣는다.


7. 항온장치 전원을 연결한다.

※ 주의 : 히터봉의 작동은 항상 물 속에 있을 때 작동시키며 사용 후 끌 때도 물속에 있는 상태에서 끄고 최소한 1분 후에 물에서 꺼낼 수 있으며 이 때 히터봉이 아직 뜨거울 수 있으므로 봉은 만지지 않도록 한다.





백 종 희

(전 경기도 광주중앙고 수석교사)


0 0